活細胞和未染色的生物標本，因細胞各部細微結構的折射率和厚度的不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化(振幅差)，這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細胞和未染色的標本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌， 用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。

　　相差顯微鏡具有兩個其他顯微鏡所不具有的功能:

　?、賹⒅鄙涞墓?視野中背景光)與經物體衍射的光分開；

　　②將大約一半的波長從相位中除去，使之不能發(fā)生相互作用，從而引起強度的變化。

　　相差顯微鏡*大的特點是可以觀察未經染色的標本和活細胞。

　　 相差顯微鏡的基本原理是，利用物體不同結構成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉變?yōu)檎穹ü鈴姸龋┑牟顒e，經過帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實現(xiàn)觀測的顯微鏡。主要用于觀察活細胞或不染色的組織切片，有時也可用于觀察缺少反差的染色樣品。

　　 把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差。

　　在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處：

　　1.環(huán)形光闌（annular diaphragm） 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空 心光錐，焦聚到標本上。

　　2.相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

　　1.A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加變亮，形成亮反差（或稱負反差）。

　　2.B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結構比周圍介質更加變暗。

　　相差顯微鏡使用中的幾個問題：

　?。?）相位倒轉 當n’n時得到象的明暗反差正好相反，稱為相位倒轉。當相位差δ=0時是無法識別的，隨著δ的增大反差變大，當δ繼續(xù)增大到某一值后會出現(xiàn)相位倒轉。用90%高吸光值（高反差）物鏡時，這個轉變值約為0.55λ，用70%標準吸光值的物鏡時約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應該用于分辨較小的光程差。

　　（2）暈輪和漸暗效應 在相差顯微鏡成象過程中，某一結構由于相位的延遲而變暗時，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結果。因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點，它妨礙了精細結構的觀察，當環(huán)狀光闌很窄時暈輪現(xiàn)象更為嚴重。相差顯微鏡的另一個現(xiàn)象是漸暗效應，指相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時，該區(qū)域邊緣會出現(xiàn)反差下降。

　?。?）樣品厚度的影響 當進行相差觀察時，樣品的厚度應該為5μm或者更薄，當采用較厚的樣品時，樣品的上層是很清楚的，深層則會模糊不清并且會產生相位移干擾及光的散射干擾。

　?。?）蓋玻片和載玻片的影響 樣品一定要蓋上蓋上蓋玻片，否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。相差觀察對載玻片和蓋玻片的玻璃質量也有較高的要求，當有劃痕，厚薄不均或凹凸不平時會產生亮環(huán)歪斜及相位干擾。另外玻片過厚或過薄時會使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。