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雙光子顯微鏡簡介 - 分析行業(yè)新聞
來源: | 發(fā)布日期:2023-01-27 16:07
 

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術。
雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子,在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,為了不損傷細胞,雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脈沖寬度只有 100 飛秒,而其周期可以達到 80 至 100 兆赫。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,物鏡的焦點處的光子密度是*高的,雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上,所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔,提高了熒光檢測效率。為形態(tài)學、分子細胞生物學、神經(jīng)科學、和藥理學等研究領域中重要的研究手段。

市場產(chǎn)品供應商有徠卡(Leica) ??????y????????V3930 公司:雙光子顯微鏡Leica TCS MP,蔡司(ZEISS)公司:LSM 510 META。

1.雙光子顯微鏡出現(xiàn)的背景----傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡的兩大局限:
1)一是光毒性現(xiàn)象:因為共聚焦的針孔必須足夠小以獲得高分辨率的圖像,而孔徑小又會擋掉很大部分從樣品發(fā)出的熒光,包括從焦平面發(fā)出的熒光,相應的,激發(fā)光必須足夠強以獲得足夠的信噪比;而高強度的激光會使熒光染料在連續(xù)掃描過程中迅速褪色,熒光信號會隨著掃描進程度進行變得越來越弱。
2)光毒作用是另外一個問題,在激光照射下,許多熒光染料分子會產(chǎn)生諸如單態(tài)氧或自由基等細胞毒素,所以實驗中要限制掃描時間和激發(fā)光的光功率密度以保持樣品的活性。在針對活性樣品的研究中,尤其是活性樣品生長、發(fā)育過程的各個階段,光漂白和光毒現(xiàn)象使這些研究受到很大的限制。

2.為什么說雙光子顯微鏡一般不需要配備紫外激發(fā)激光器?
雙光子顯微鏡技術是建立在雙光子激發(fā)效應的基礎上的一種熒光激發(fā)技術:熒光染料分子可以同時吸收低能量的兩個光子而被激發(fā)(兩個光子到達熒光分子的時間間隔小于1飛秒),其激發(fā)效果可以等同于吸收一個1/2波長的高能量光子。例如,吸收兩個紅色波長的光子,相當于一個吸收紫外的分子。長波長的光子不易被細胞吸收,因此對活細胞的光毒性減少,也降低了光漂白。這樣即起到紫外激發(fā)的功能,又避免了紫外光線對樣品的傷害。

3.雙光子顯微鏡的激光器有何特別之處?
雙光子吸收幾率依賴于兩個入射光子在空間和時間上的重合程度(兩個光子必須在10-18秒內(nèi)到達)。雙光子吸收截面很小,只有在具有很大光子流量的區(qū)域的熒光團才會被激發(fā)。因此所用激光器多為鈦寶石激光器,可以達到皮秒或者飛秒級的掃描速度,且具有非常高的峰值功率和較低的平均功率,從而可以減小或者消除光漂白和光毒作用。*主要的是在一個很小的范圍提供非常高密度的光子,可以保證雙光子的同時激發(fā)。

4.雙光子激發(fā)的優(yōu)點是什么?
1)增加了染料的選擇性:共聚焦系統(tǒng)的激光器(Ar, Ar/Kr, HeNe)的激發(fā)光范圍在 488nm - 647nm
。這就意味著想用紫外激發(fā)熒光染料的實驗進行,例如使用 DAPI , Hoescht
。而雙光子的激發(fā)波長是單光子的兩倍,所以紫外激發(fā)的染料能被近紅外光激發(fā)。
2)減少光漂白:因為光漂白減少的減少使得用 CFP/YFP 做熒光共振能量轉移( FRET )的實驗的成功率提高。
3)無需特殊的物鏡:從硬件的角度出發(fā),用近紅外光的波長激發(fā)紫外激發(fā)染料不需要特殊的紫外光學組件。
4)提高信噪比:激發(fā)光波長和發(fā)射光波長具有很大的差別,提高了信噪比。
5)漂白局限于焦點處:因為熒光激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上,所以就不需要共聚焦針孔了。這樣提高了光的檢測,而且光漂白只發(fā)生在焦點上。
6)更容易穿透標本:紅外波長的光不易被細胞散射,能穿透更深的標本。

5.相對于激光掃描共聚焦顯微鏡,雙光子顯微鏡做的*大改進是什么?
1)減少了光漂白。
2)減少了光毒性。
3)不易散射,更易穿透厚樣品,諸如腦片。

【本文標簽】

【責任編輯】微儀顯微鏡

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